Travaux Pratiques : Facteurs impliqués dans le déséquilibre osmotique.


Résumé : Les globules rouges contenus dans le sang de lapin comme toutes les cellules animales ont une membrane très particulière et possédant de nombreuses propriétés. En effet elles sont semi perméable. Certaines substances pourront diffuser librement (eau, NO, CO2, O2, Urée) alors que d’autres molécules, plus grosses ou polaires, ne pourront pas traverser la membrane. Cette dernière permet de maintenir constante les concentrations intra et extracellulaires de divers ions (K+ et Na+). Dans le cas d’un déséquilibre la cellule mourra (lyse). De part sa nature lipidique, la membrane sera plus perméable aux composés apolaires. Les molécules non diffusibles traverseront la membrane par des canaux spécifiques qui sont des protéines. Certains ions utilisent ces canaux pour diffuser dans le sens de leur gradient, mais des structures spécifiques sont nécessaires pour rétablir les concentrations ; ces pompes protéiques qui utilisent de l’énergie sous forme d'ATP ne fonctionnent que dans certaines conditions .



Introduction

La cellule contrôle en permanence les échanges au travers de la membrane plasmique, ce contrôle explique les différences de concentrations de plusieurs ions ou de petites molécules entre le cytosol et le milieu extracellulaire. Le potassium est l’ion le plus abondant dans le cytosol. La concentration des ions sodium chlore et calcium sont plus important à l’extérieur du cytosol. Ces ions ne peuvent diffuser librement contrairement à l’eau. Pour que les cellules soient en équilibre osmotique, il faut que la quantité de solutés non diffusibles soit égale de part et d’autre de la membrane. Si les cellules sont placées dans un milieu isotonique de solutés non diffusibles, le volume ne changera pas. Si elles sont placées dans une solution hypertonique de soluté non diffusibles, les cellules vont perdre de l’eau et si elles sont placées dans un milieu hypotonique les cellules vont gonflées, et comme la membrane n’est que très légèrement élastique les cellules vont être lysées, nous allons ainsi tenter de déterminer l’osmolarité intracellulaire. Les vitesses d’hémolyse nous permettront de déterminer les facteurs qui influent sur la perméabilité membranaire.






Matériels et méthodes :

Support : Nous allons travailler sur du sang de lapin. Nous utiliserons les propriétés de la membrane plasmique et en particulier sa faible plasticité pour déterminer les facteurs qui influent sur la perméabilité membranaire et donc sur la lyse.
Conditions : La grande majorité des expériences se feront à température ambiante, mais certains échantillons seront conservés une semaine à 4°C afin de ralentir le métabolisme.
Appareils : Nous utiliserons la colonne H.P.L.C afin de déterminer les concentrations en sodium et potassium ainsi que le spectrophotomètre pour mesurer la concentration d’hémoglobine.
Produits : Certains produits sont dangereux, l’acétonitrile par exemple ne se manipule que sous la hotte. Le Drabkin (qui contient du cyanure) doit être utilisé avec beaucoup de précaution.

Résultats :

Comparaison des effets de substances électrolytes ou non électrolytes.






Corrélation entre perméabilité et coefficient de partage

Ici nous allons prendre du méthanol, éthanol, propanol et butanol auxquels nous ajouterons 2 gouttes de sang dans chacun. Le protocole sera le même pour chacune des manipulations.






On observe que la lyse est plus rapide avec les longues chaînes carbonées et les grands coefficients de partage

Effet de la taille des solutés hydrophiles

Ici nous ajouterons du sang à de l’urée, de l’éthylène glycol, du glycérol et du glucose.




Le temps de lyse est proportionnel à la taille des molécules. Le glucose ne lyse pas la cellule

Effet des groupes polaires

Nous allons maintenant tester la polarité des groupements et l’influence sur les cellules.
Les molécules non chargées rentrent plus facilement dans la cellule.




On voit que l’éthylène glycol met 27 secondes à provoquer la lyse. L’éthylène glycol doit être très polarisé et donc il diffuse lentement.

Mesures des concentrations de sodium et de potassium intra et extracellulaire

Concentrations Extracellulaires : À partir de notre échantillon de sang et après centrifugation, nous allons prélever du plasma. On rajoute un volume d’acétonitrile. Ce dernier permet de faire précipiter les protéines. Ensuite, on dilue 50 fois avec de l’eau afin de pouvoir mesurer les concentrations par l’H.P.L.C. (le taux final de dilution est de 1/100). On exécute le même protocole à partir des tubes à 4°C.
A partir des courbes on observe les concentrations, il faut prendre en compte le facteur de dilution
[Na+]Extra : 384 mM
[K+]Extra : 10 mM
[Na+]Extra froid: 355 mM
[K+]Extra froid: 79 mM

Concentrations Intracellulaires : À partir du même échantillon de sang et toujours après la centrifugation, nous lavons notre culot avec du tampon choline. Nous refaisons une centrifugation et nous ne gardons que le culot. Nous rajoutons un volume d’acetonitrile (dilution 2 fois), et nous centrifugeons. Nous aurons, dans le surnageant, le contenu cytoplasmique. Nous prélevons donc du surnageant que l’on dilue.
On exécute le même protocole à partir des tubes à 4°C.
[Na+]Intra : 21 mM
[K+]Intra : 213 mM
[Na+]Intra froid : 42 mM
[K+]Intra froid : 159 mM

Détermination de la concentration en Hémoglobine

Nous allons prélever du plasma que nous mélangeons au Drabkin. En mesurant la densité optique à 540 nous pourrons ainsi déterminer la concentration de globule rouge.

D.O540, Plasma = 0
D.O540, Plasma froid = 0

D.O540, Globule Rouge = 512
D.O540, Globule Rouge froid = 373

En fonction de la courbe étalon, nous allons retrouver la concentration d’hémoglobine.





Donc nos concentrations sont :

[Hb] = 178 mg / ml
[Hb] froid = 135 mg / ml

Discussions et conclusion

Nous avons étudié différents facteurs qui peuvent jouer un rôle important dans la lyse des globules rouges. Leurs natures mais aussi leurs concentrations peuvent avoir un impact sur la stabilité membranaire. Les solutés qui ne diffusent pas librement engendrent des mouvements d’eau et un changement de volume de la cellule. Ainsi dans le cas du sodium et du saccharose on voit que pour de très faibles concentrations extérieures, l’eau qui va pénétrer dans la cellule a tendance à rétablir un équilibre d’osmolarité et provoquer sa lyse. Il est important de remarquer que les concentrations qui provoquent la lyse sont deux fois plus petites dans le cas du NaCl. Ceci est dû à son osmolarité deux fois plus grande. L’osmolarité est le nombre de particules en solution dans un litre de solution. On observe que plus les concentrations extracellulaires sont importantes plus les cellules vont être crénelées. Nous pouvons déduire que la concentration intracellulaire en saccharose se situe aux alentours de 0.20 Molaire, et celle de sodium aux alentours de 0.12 Molaire. En effet c’est à cette concentration que les cellules ont une forme « conventionnelle ». Ensuite nous avons observé les effets de la nature des composés. De par sa composition lipidique, la membrane laissera plus facilement passer les composés apolaires : c'est-à-dire les composés qui ont un coefficient de partage élevé. Ce coefficient de partage est le rapport entre la solubilité d’une substance dans les lipides sur sa solubilité dans l’eau. En général augmenter la solubilité dans les lipides revient à augmenter la longueur de la chaîne carbonée et donc du poids moléculaire. La longueur de la chaîne va déstabiliser la membrane et la rendre perméable. Nous avons aussi testé la capacité de la membrane à faire rentrer les molécules de tailles différentes. Nous vérifions que les molécules larges ont du mal à rentrer, ceci nous laisse penser qu’il existe des canaux spécifiques, et qu’ils ne permettent pas de laisser passer certaines molécules dont la masse est trop élevée : le glucose ne pourra pas passer. Le coefficient de corrélation nous montre que le temps de lyse est proportionnel à la masse molaire. Enfin nous avons essayé de déterminer les conditions électriques de la membrane grâce à la constante diélectrique. Elle mesure le degré auquel une substance peut stocker des charges électriques lorsqu’on lui applique un certain potentiel ; la constante diélectrique d’un matériau dépend de la distribution des charges à l’intérieur de la molécule. En ce qui concerne les concentrations de potassium, de sodium et d’hémoglobine, nous avons pu les mesurer grâce à la colonne H.P.L.C et le spectrophotomètre. Nous observons tout d’abord que la concentration du sodium intracellulaire des échantillons maintenus au froid est plus importante que la même concentration des échantillons à température ambiante. Il en est de même pour la concentration de potassium extracellulaire. Ce qui est propre aux échantillons maintenus au froid est que le métabolisme est considérablement freiné. Les échanges passifs ne nécessite pas d’énergie et se feront même dans des conditions difficiles. Par contre les transports nécessitant de l’énergie ne pourront plus s’effectuer. On peut donc en déduire que c’est un transport actif qui permet transporter le sodium de l’intérieur vers l’extérieur et le potassium de l’extérieur vers l’intérieur. Cette protéine est la pompe Na+-K+-ATPase. Ceci nous est confirmé par les mesures des concentrations d’hémoglobine. En effet, on voit qu’avec les échantillons maintenus au froid la concentration est moins importante. La sortie de Na+ ne pouvant plus s’effectuer il va y avoir une entrée massive d’eau et cette entrée va diluer l’hémoglobine.

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